国家卫生和计划生育委员会办公厅


关于印发《医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序》等技术规范的通知

　　
卫办医政函〔2013〕402号



各省、自治区、直辖市卫生厅局（卫生计生委），新疆生产建设兵团卫生局：

　　根据人感染H7N9禽流感疫情联防联控工作机制会议议定事项及《关于医院开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测有关工作的通知》（卫办医政函〔2013〕383号，以下简称《通知》）精神，为指导医院做好人感染H7N9禽流感病毒核酸检测工作，我委组织制定了《医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序》（附件1），并委托中国疾控中心制定了《人感染H7N9禽流感病毒核酸检测实验室生物安全保障基本要求》（附件2）等技术规范。现转发给你们（可从国家卫生和计划生育委员会网站医政管理栏目中下载），供医院在开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测时参考使用。

　　各省级卫生（卫生计生）行政部门要按照《通知》有关要求，组建省级疾控机构实验室和省级临床检验专家共同组成的专家组，对医院开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测工作提供技术指导和支持，负责医院实验室核酸检测质量控制工作。要组织本辖区人感染H7N9禽流感病毒核酸检测定点医院检验人员进行培训，认真学习掌握相关要求，提高检验人员技术能力和水平。医院开展病毒核酸检测时，应当按照技术规范有关要求，规范开展检测工作，重视实验室质量控制，保障实验室生物安全，做好检验人员职业防护，保证检测结果科学、可靠。



附件：1.医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序.docx

2.H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书.docx



国家卫生和计划生育委员会办公厅

2013年5月16日





医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序


　　　　 
　　　　一、目的
　　　　确保人感染H7N9禽流感病毒核酸检测过程标准化、规范化，降低人为不规范操作对检测结果造成的影响，保证结果的准确性和可重复性。
　　　　二、适用范围
　　　　医疗机构临床基因扩增检验实验室按照《关于医院开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测有关工作的通知》（卫办医政函〔2013〕383号）和《关于做好医疗机构人感染H7N9禽流感检测试剂供给保障工作的通知》（卫发明电〔2013〕29号）有关要求，使用国家疾病预防控制中心制备或商品化试剂盒开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测工作。
　　　　三、样本采集、运送和保存
　　　　尽量采集病例发病早期的呼吸道样本(上呼吸道样本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液, 下呼吸道样本包括痰液、气管吸取物、肺洗液、肺组织等)。可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高检出率。患者有下呼吸道样本时，应优先采集。
　　　　根据试剂说明书对样本采集方法有关要求，制订样本采集标准操作程序（SOP），并组织样本采集人员进行培训及考核。样本的采集应当严格按照SOP进行。
　　　　样本采集后，按照《人间传染病的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒的相关规定进行包装，用密封容器立即送往实验室。若气温高时，需放入冰块降温。样本抵达实验室后，应尽快进行检测，24小时内能检测的样本可置于2～8℃暂时保存，24小时内无法检测的样本则应置于≤-70℃状态保存。如无-70℃保存条件时，可于-20℃冰箱暂存。样本避免反复冻融。
　　　　样本采集、处理、运输及保存不当时，可因病毒RNA降解出现假阴性结果，也可因为样本“污染”出现假阳性结果。
　　　　四、PCR检测
　　　　（一）样本处理
　　　　样本的核酸提取应当在样本处理区进行。按所采用的商品化试剂盒说明书要求，取适量待检样本、阳性及阴性对照进行核酸提取。样本应尽可能新鲜，提取过程应严防RNA酶污染及操作不当导致的RNA降解。提取过程如涉及离心步骤，应采用低温冷冻离心机；在生物安全柜内进行加样、提取过程中，为防止RNA降解，可将试管架置于托盘内平铺的碎冰上。提取好的RNA应及时用于检测，否则应当-70℃保存。如无-70℃保存条件，可于-20℃冰箱暂存。
　　　　（二）试剂准备
　　　　试剂准备应当在试剂准备区进行。根据所用的试剂盒，样本可进行甲型流感病毒核酸、禽流感H7亚型或H7N9病毒核酸的检测。试剂的配制按所用商品化试剂盒说明书进行。除酶混合物外，其它试剂在使用前应当在室温充分复融，混匀并瞬时低速离心。反应液分装时尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免管内溶液泄露污染仪器。分装有扩增反应液的反应管应当扣盖或装入密实袋内再转移至样本处理区。
　　　　（三）加样
　　　　加样应当在样本处理区进行。加样时应当使样品完全落入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。
　　　　按试剂、仪器说明书完成加样和PCR反应管准备。
　　　　（四）PCR扩增检测
　　　　PCR扩增检测在扩增区进行。待检PCR管转移至扩增区，按顺序置于PCR仪上，编辑样本信息，按试剂和仪器说明书设定循环参数。
　　　　（五）结果分析
　　　　根据所用试剂盒说明书设置基线值（baseline）。荧光阈值（threshold）设定以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点为原则，且Ct值应大于所设置的扩增循环数（或显示为undet）。使用仪器配套软件自动分析结果。
　　　　（六）质量控制
　　　　检测过程对可能出现的假阳性和假阴性进行质量控制，除了检测商品试剂盒所提供阳性和阴性对照外，每次临床样本检测时，至少应当有1份弱阳性和3份阴性质控样本（多份阴性质控样本设置对实验室“污染”所致假阳性的监控更为有效），随机放在所检测标本的中间。弱阳性质控样本可为检测阳性的灭活稀释后保存的临床样本、灭活病毒或假病毒颗粒等，如所采用的商品化试剂盒有“内标”控制假阴性，或弱阳性质控样本来源困难，可暂不设弱阳性质控。阴性质控样本采用标本采集管内溶液即可。质控样本应与临床标本同等对待，参与样本核酸提取和扩增检测全过程。
　　　　试剂盒中的阳性和阴性对照用于判断实验室的有效性，按试剂盒说明书进行。
　　　　（七）实验结果的判定与解释。
　　　　按照试剂盒说明书进行。对于出现弱阳性结果的样本应进行重复检测，并注意与可能的实验室轻度或样本交叉“污染”所致假阳性结果区别。
　　　　五、检测结果报告
　　　　按照试剂盒说明书进行。
　　　　六、其它注意事项
　　　　（一）人感染H7N9禽流感病毒实验室活动、样本采集和运输按照《人间传染的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒进行管理。从事人感染禽流感检测的技术人员必须经过生物安全培训并具备相应的实验技能，在检测过程中必须采取生物安全防护措施（使用眼罩、N95型口罩等）。样本核酸提取必须在Ⅱ级生物安全实验室，经过年检合格的二级生物安全柜内进行。实验室应具有良好的通风。
　　　　（二）注意仪器设备的日常和定期维护，加样器、扩增仪和温育设备应进行定期校准。试剂盒及一次性使用的无DNA酶和RNA酶PCR反应管、离心管、带滤芯吸头等应进行每批质检。
　　　　（三）实验应严格分区操作；各区物品、工作服等均应当专区专用，不得交叉使用。实验后应及时清洁工作台，以防污染。
　　　　（四）每批实验室后，可采取实验室通风、10%次氯酸钠溶液擦洗地台面、紫外照射等措施，消除可能存在的扩增产物气溶胶污染。
　　　　（五）使用中国疾控中心制备试剂开展检测工作时，可参考相应试剂盒说明书（见附件1、2）有关要求。
　　　　 
附件：1.H7N9亚型禽流感病毒RNA检测试剂盒（荧光PCR法）说明书
2.H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
H7N9亚型禽流感病毒RNA检测试剂盒（荧光PCR法）说明书
 
　　　　【产品名称】
　　　　通用名称：H7N9亚型禽流感病毒RNA检测试剂盒（荧光PCR法）
　　　　英文名称：Diagnostic Kit for H7N9 subtype avian flu virus RNA（Fluorescence PCR）
　　　　【包装规格】48人份/盒。
　　　　【预期用途】
　　　　本试剂用于对咽拭子样本中H7N9亚型禽流感病毒RNA进行定性检测，用于H7N9禽流感病毒感染的辅助诊断及流行病学监控。
　　　　【检验原理】根据荧光PCR技术原理，针对H7N9亚型禽流感病毒的HA基因和NA基因设计特异性引物和Taqman探针，通过荧光PCR检测仪进行检测，从而实现对H7N9亚型禽流感病毒RNA的定性检测。试剂盒以正常人上皮细胞中广泛存在的核糖核酸酶P（RNase P）的mRNA为正常人体细胞对照，对提取和检测过程进行监控。
　　　　【主要组成成分】
　　　　 
　　　 
名称 成分 　　规格 数量(管)
H7反应液 　　含内标RNP 、H7亚型特异基因的引物探针混合液 1.0ml/管 1
N9反应液 　　含内标RNP 、N9亚型特异基因的引物探针混合液 1.0ml/管 1
DNA聚合酶 　　DNA聚合酶，不可用其他同类DNA聚合酶替代 60μl /管 1
逆转录酶 　　逆转录酶，不可用其他同类逆转录酶替代 60μl /管 1
阳性对照 　　RNP、H7、N9 RNA假病毒混合物 1.0ml/管 1
阴性对照 　　DEPC水 1.0ml/管 1
　　本品各组成成分均不得与其他产品或不同批号产品中的相应组成成分进行互换。
　　 
　　　　本品不包含，但对试验必须的设备和试剂：
　　　　生物安全柜、台式离心机、旋涡震荡器、拭子、采样管、无菌病毒采样液、1.5 ml无核酸酶的离心管、全自动荧光PCR检测仪专用PCR扩增管和核酸分离试剂盒(硅胶膜吸附法，北京金豪制药股份有限公司，Cat：BJH101)。
　　　　【储存条件及有效期】-20℃冷冻保存，有效期2个月，阳性对照反复冻融次数不得超过5次。
　　　　【适用仪器】RG3000、LightCycler、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自动荧光PCR检测仪。
　　　　【样本要求】
　　　　1. 样本类型：咽拭子。推荐使用金豪公司生产的微生物采样及运送管（12人份/盒）。
　　　　2. 拭子、采样管和保存液：
　　　　2.1拭子选择：应使用头部为合成纤维（例如，聚酯纤维），杆部为铝或塑料的拭子。
　　　　2.2采样管：外螺旋口、耐-70℃冻存，可容纳3 ml病毒采样液。
　　　　2.3无菌病毒采样液：应含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生产的抗生素，缓冲液，经无菌处理。
　　　　3.样本采集、运输和保存：
　　　　由于H7N9亚型禽流感病毒为呼吸道传播病毒，有关生物安全应按照“《人间传染的病原微生物名录》”中高致病性禽流感病毒进行管理。
　　　　3.1采集：采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用微生物采样及运送管内的采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3ml保存液的15ml外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。4℃暂存并在48小时内送达实验室。
　　　　3.2保存和运输：新鲜采集样本应在4℃条件下48小时运送到检测实验室。保存样本可在-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。冷冻样本应在冷冻条件下送至实验室。运输时在包装箱内填充吸水材料，运输过程中保持标本采集管直立状态，不能倾斜。
　　　　样本送至实验室后，立即进行处理和分装，避免反复冻融。临床样本保存在4℃不能超过4天。
　　　　4.咽拭子标本的处理
　　　　咽拭子要在标本保存液中充分搅动（至少 40 下），以洗脱拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融），使细胞破裂，释放病毒颗粒。然后在4℃条件下，10000rpm离心20分钟，用上清接种细胞或直接提取RNA。如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。
　　　　【检验方法】
　　　　1. 核酸提取：
　　　　取200μl咽拭子样本进行核酸提取。采用北京金豪制药股份有限公司的核酸分离试剂盒 (硅胶膜吸附法)，该试剂盒可用于对呼吸道悬浮液样本中的病毒RNA提取，并按试剂盒说明书要求操作。
　　　　本品的阳性对照和阴性对照均参与核酸提取。
　　　　1.1. 准备及注意事项：
　　　　1.1.1 分别在洗液A瓶和洗液B瓶中加入16ml和60ml无水乙醇，颠倒充分混匀，并在瓶身上加以标识。
　　　　1.1.2  吸取所需的洗脱液，加至一无核酸酶的eppendorf管中，于70℃预热。
　　　　1.1.3  冷冻样本应室温融化，轻微震荡混匀后使用。
　　　　1.1.4  区分操作中的离心设置（rpm和g），本产品操作过程均为室温离心。
　　　　1.1.5  助沉剂在低温保存时可能呈胶状，吹打混匀即可使用。
　　　　1.2. 样本裂解及核酸吸附
　　　　1.2.1  在1.5ml无核酸酶的离心管中加入10μl助沉剂和400μl裂解液，加入200μl待处理样本，剧烈震荡2分钟，室温静置10分钟。
　　　　注：如样本体积小于或大于200μl，需按比例改变助沉剂、裂解液以及无水乙醇体积。体积大于400μl样本应分多次进行处理。
　　　　1.2.2  加入480μl无水乙醇，颠倒混匀，吸取600μl裂解混合物转移到核酸吸附柱中。
　　　　注：如样本体积小于或大于200μl，需按比例改变乙醇用量。
　　　　1.2.3  3500g离心2分钟，取下套管，倒掉套管中的液体。将剩余裂解混合物转移至核酸吸附柱，重新离心一次，弃套管中的液体。
　　　　1.2.4  将核酸吸附柱重新装入套管，6000g离心1分钟，倒掉套管中的液体。
　　　　1.3. 核酸纯化
　　　　1.3.1  将核酸吸附柱重新装入套管，在核酸吸附柱中加入500μl洗液A，6000g离心1分钟，将核酸吸附柱装入一个干净套管中。
　　　　1.3.2  在核酸吸附柱中加入500μl洗液B，静置1分钟，6000g离心1分钟。
　　　　1.3.3  倒掉套管中的液体，将核酸吸附柱重新装入套管。
　　　　1.3.4  重复一次1.3.2步骤(本步骤不用静置1分钟)。
　　　　1.3.5  将核酸吸附柱换一新套管，13000rpm离心3分钟。
　　　　1.4. 核酸洗脱
　　　　1.4.1  将核酸吸附柱装入一无核酸酶1.5ml离心管，小心在吸附膜中央加入50μl预热洗脱液，室温静置4分钟。
　　　　1.4.2  10000 rpm离心2分钟，离心管中液体即待测样本RNA。
　　　　2. PCR扩增：
　　　　2.1 实验设计：
　　　　2.1.1待检样本检测：每份样本分别使用2种反应液（H7和N9反应液）进行检测，综合2种反应液的检测结果对样本进行判定。
　　　　2.1.2对照品检测：每次试验都应设置阴性对照和阳性对照。
　　　　2.2反应体系的配制：
　　　　2.2.1准备工作：将2种反应液（H7和N9反应液）融化后振荡混匀，离心6000rpm 10秒。
　　　　2.2.2 2种反应体系（H7和N9）的配制：取2个1.5ml 无核酸酶离心管，计算待测样本数量(n)，分别取20μl×（n+2）反应液（H7和N9）、0.5μl×（n+2）DNA聚合酶和0.5μl×（n+2）逆转录酶充分混匀，离心6000rpm 10秒。
　　　　n + 2 = n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照；
　　　　2.3反应体系分管：
　　　　每份待测样本设置2个PCR扩增管（H7和N9），分别将每种反应体系按20μl/管分装至对应的PCR扩增管中。
　　　　2.4加样：
　　　　每份待测样本RNA、阳性对照、阴性对照以5μl/管分别加入2个PCR扩增管中。
　　　　2.5扩增检测：
　　　　将加样后的PCR扩增管分别转移到全自动荧光定量PCR检测仪上进行扩增检测，不同仪器的设置如下：
　　　　2.5.1全自动荧光定量PCR检测仪（RG3000、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型）扩增程序：
　　　　对于ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自动荧光定量PCR检测仪，荧光信号设置为：Reporter Dye1：FAM、JOE/VIC，Quencher Dye1：NONE，Passive Reference：NONE。其他型号仪器可设置为FAM和HEX通道。荧光PCR扩增程序的设置见表1。反应总体积为25μl。
表1.荧光PCR扩增程序
　　步骤 　反应温度 　　时间 是否采集光 循环数
　　逆转录及变性 　50℃ 　30分钟 　　否 　　1
　95℃ 　3分钟 　　否
　　预扩增 　95℃ 　15秒 　　否 　　5
　50℃ 　30秒 　　否
　72℃ 　1分钟 　　否
　扩增及荧光收集 　95℃ 　10秒 　　否 　　40
　55℃ 　40秒 　　是
　　　　2.5.2 全自动荧光定量PCR仪（Roche LightCycler系列）扩增程序：
　　　　选择FAM、HEX通道收集荧光。荧光PCR扩增程序见表2。
表2.荧光PCR扩增程序
　　步骤 反应温度 　　时间 是否采集荧光 循环数
逆转录及变性 50℃ 　　30分钟 　　否 　　1
93℃ 　　3分钟 　　否
　　预扩增 93℃ 　　15秒 　　否 　　5
50℃ 　　30秒 　　否
72℃ 　　1分钟 　　否
扩增及荧光收集 93℃ 　　10秒 　　否 　　40
55℃ 　　40秒 　　是
　　 
　　　　3. 结果分析：
　　　　3.1本品H7荧光探针的报告荧光为FAM，N9荧光探针的报告荧光为FAM，RNP荧光探针的报告荧光为HEX。所以应选择FAM通道和HEX通道分析试验结果。
　　　　3.2 基线（Baseline）范围根据仪器要求设定，目的为校正背景荧光干扰，终止循环（End）一般设置为最强样本出现扩增信号的前3-4个循环。
　　　　3.3 阈值线用于判断样本是否扩增，应调整使阈值线高于荧光背景和阴性对照的荧光信号，或点击分析（Analysis）自动获得。
　　　　4. 质量控制：
　　　　每次试验应设置阳性对照和阴性对照，且应符合以下要求，否则试验结果不成立。
　　　　4.1阴性对照无Ct值或Ct值为0。
　　　　4.2 阳性对照Ct值小于30.0。
　　　　【参考值（参考范围）】
　　　　Ct值≤37.0报告该反应阳性；
　　　　无Ct值或Ct值为0报告该反应阴性；
　　　　37.0＜Ct值＜40.0为灰区；
　　　　内标RNP有效的范围为：0＜Ct值＜33.0；
　　　　【检验结果的解释】
　　　　1. 在内标RNP结果成立的条件下各种判读模式如下：
反应液 模式1 模式2 模式3 模式4
H7 - - + +
N9 - + - +
RNP + + + +
结果判断 H7N9亚型禽流感病毒RNA阴性 H7N9亚型禽流感病毒RNA阴性 H7N9亚型禽流感病毒RNA阴性 H7N9亚型禽流感病毒RNA阳性
　　注：在内标RNP结果不成立的条件下视为检测异常，应重新采样检测。
　　　　2. 结果在灰区的样本需重复试验：取200μl样本重新提取RNA（核酸分离试剂盒中裂解液、无水乙醇的用量加倍，其他组分的用量不变）并检测。复检结果Ct＜40.0的样本为阳性，否则为阴性。
　　　　3. 内标RNP检测靶物质为正常人上皮细胞中广泛存在的核糖核酸酶P（RNase P）的mRNA，用于对样本中RNA的提取和扩增检测过程进行有效监控。
　　　　如果该份样本的RNP检测 Ct值≥33.0，可能为以下原因：
　　　　3.1 未采集到足够的正常人上皮细胞，应重新采样。
　　　　3.2核酸提取过程异常，导致RNA损失，应重新提取。
　　　　3.3样本中存在RT-PCR抑制物质，可稀释后检测；
　　　　【检验方法的局限性】
　　　　1.样本中RNA浓度低于本产品的最低检出值（100copies/ml）时可能出现假阴性。
　　　　2.目前研究显示，发病后两日内取样检测，病毒RNA检出率最高，随发病时间的延长，病毒被清除，病毒核酸的检出水平迅速下降。因此应在发病后尽早采样，必要时可采用多部位取样检测。临床评价应结合其他临床症状和实验室检测指标进行判断。
　　　　【产品性能指标】
　　　　1.本品可最低检出100copies/ml稀释物。
　　　　2.本品对季节性流感（H1N1以及H3N2）灭活病毒、B型流感灭活病毒、高致病性禽流感灭活病毒（H5N1）RNA进行检测，结果为阴性。
　　　　【注意事项】
　　　　1.开始检测前请仔细阅读本说明书全文，并严格按照要求进行操作。
　　　　2.实验室配置和试验操作请按照《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》和《临床基因扩增检验实验室工作规范》进行；整个检测过程应严格分区进行：PCR反应体系的配置区；标本处理、加样区；各区使用的仪器、设备、耗材和工作服应独立专用。
　　　　3.H7N9亚型禽流感为经呼吸道传播疾病，应按照相关要求进行。样本的采集、处理、运输和保存均存在一定生物危害。样本的采集、运输和保存应按照乙类传染病进行管理；标本的提取必须在生物安全二级实验室的负压生物安全柜中完成；试验中接触过标准品和对照品的废弃物品（如吸头）、扩增完毕的离心管、标本等应进行无害化处理后方可丢弃。
　　　　4.不同批号的试剂请勿混用，请在有效期内使用试剂盒。
　　　　5. 本产品仅用于体外诊断检测。
　　　　【参考文献】
　　　　1. 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则（WS 233-2002）
　　　　2.《人感染H7N9禽流感诊疗方案（2013年第2版）》
　　　　3.《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号）
　　　　【生产企业】
　　　　企业名称：北京金豪制药股份有限公司
　　　　生产地址：北京市北京经济技术开发区运成街7号
　　　　注册地址：北京市北京经济技术开发区运成街7号1号楼
　　　　邮政编码：100176
　　　　电话号码：010-67878866
　　　　传真号码：010-67881632
　　　　网    址：www.kinghawk828.com
　　　　【医疗器械生产企业许可证编号】京药监械生产许20050017号
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　

H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒
（PCR-荧光探针法）说明书
　　　　 
　　　　【产品名称】通用名称：H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
　　　　英文名称：Detection Kit for Avian Influenza Virus Subtype H7N9 RNA (PCR-Fluorescence Probing)  
　　　　【包装规格】大包装，48反应/盒
　　　　【预期用途】
　　　　流感病毒可分为甲（Ａ）、乙（Ｂ）、丙（Ｃ）三型。其中，甲型流感依据流感病毒血凝素蛋白（HA）的不同可分为1-16种亚型，根据病毒神经氨酸酶蛋白（NA）的不同可分为1-9种亚型，HA不同亚型可以与NA的不同亚型相互组合形成不同的流感病毒。而禽类特别是水禽是所有这些流感病毒的自然宿主，H7N9禽流感病毒是其中的一种。H7N9流感病毒既可以感染禽类，也可以感染人。人感染H7N9禽流感会出现严重肺炎，症状包括发烧、咳嗽、呼吸困难等。
　　　　本试剂盒适用于检测呼吸道样本、血清、肺组织等样本中H7N9禽流感病毒RNA，可用于该病毒感染的实验室诊断和宿主动物的监控。检测结果仅供研究，不用于临床诊断。
　　　　【检验原理】
　　　　本试剂盒基于实时荧光PCR技术，分别选取H7N9禽流感病毒的HA基因和NA基因保守区作为扩增靶区域，设计特异性引物探针，通过一步法实时荧光PCR体系扩增对H7N9禽流感病毒进行定性检测。反应体系中除特异性引物和特异性荧光探针外，还配以对应的PCR反应Buffer、逆转录酶、Hot-Start Taq酶、核苷酸单体（dNTPs）、Mg2+等成分，可实现对H7N9禽流感病毒核酸灵敏特异地检测。
　　　　【主要组成成分】
组分名称 规格 数量
PCR检测试剂 AIV H7 PCR反应液A 816µl/管 1
AIV N9 PCR反应液A 816µl/管 1
AIV H7N9 PCR反应液B 288µl/管 1
AIV H7N9内标溶液 240µl/管 1
质控品 阴性质控品  200µl/管 1
AIV H7N9阳性质控品 200µl/管 1
 
　　　　【储存条件及有效期】保存于-20±5℃，反复冻融次数＜5次，有效期9个月。
　　　　【适用仪器】ABI 7500、ABI 7300、LightCycler480等荧光定量PCR仪。
　　　　【样本要求】
　　　　1 适用样本类型：呼吸道样本、血清、肺组织。
　　　　2 样品采集、保存与运送。
　　　　标本采集、保存、运送请遵循《人感染H7N9禽流感病毒标本采集及实验室检测策略》。
　　　　【检验方法】
　　　　1.核酸提取
　　　　建议取200µl液态样本进行核酸提取；组织样本可以研磨液进行提取操作。可采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取试剂盒，请按照试剂盒说明书进行操作；也可选择其他合适的商业化产品。本试剂盒中的内标溶液参与提取过程，若提取试剂盒中未说明内标的使用方法可在每200µl样本中加入4µl内标溶液后进行核酸提取。
　　　　本试剂盒中的阴性质控品参与提取，用于对环境进行监控；AIV H7N9阳性质控品不参与提取，用于PCR检测试剂的质控。
　　　　2.PCR扩增（ABI 7500仪器操作为例，ABI 7300、LC480等仪器参照此操作及仪器操作手册）
　　　　2.1分别配制AIV H7 RT-PCR反应体系和AIV N9 RT-PCR反应体系
　　　　2.1.1 AIV H7 RT-PCR反应体系配制
　　　　取适量PCR反应管（按AIV H7反应体系计算）；每管加入AIV H7 PCR反应液A 17µl、AIV H7N9 PCR反应液B 3µl（也可按照单个反应的用量，计算PCR反应液A、B各自所需总量，两者混匀后分装20µl于单个PCR反应管中）。
　　　　2.1.2 AIV N9 RT-PCR反应体系配制
　　　　取适量PCR反应管（按AIV N9反应体系计算）；每管加入AIV N9 PCR反应液A 17µl、AIV H7N9 PCR反应液B 3µl（也可按照单个反应的用量，计算PCR反应液A、B各自所需总量，两者混匀后分装20µl于单个PCR反应管中）。
　　　　2.2 于上述PCR反应管中分别加入处理后的阴性质控品、AIV H7N9阳性质控品、待测标本核酸各5µl，8,000rpm离心数秒，放入PCR扩增仪。
　　　　2.3探针检测模式设置为：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye：NONE，Reporter Dye2：Vic，Quencher Dye2：NONE， Passive Reference：NONE。反应条件设置为：50℃ 15min，1个循环；95℃ 15分钟，1个循环；94℃ 15秒→58℃ 45秒（收集荧光），45个循环。保存文件，运行。
　　　　3.结果分析
　　　　3.1 反应结束后保存检测数据文件。
　　　　3.2 分析条件设置：根据分析后图像调节Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线），点击Analysis自动获得分析结果，在Report界面察看结果。
　　　　【质量控制】
　　　　阴性质控品：FAM检测通路扩增曲线无对数增长期，VIC检测通路扩增曲线为明显对数增长期；
　　　　阳性质控品：FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，且FAM检测通道扩增曲线 Ct值≤32；
　　　　以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
　　　　【结果判定】
　　　　1.如果检测样品的AIV H7及N9 RT-PCR反应体系FAM检测通道均无扩增曲线或Ct值＞40，且在VIC检测通道均有对数增长期，可判样品为H7N9禽流感病毒阴性；
　　　　2.如果检测样品的AIV H7及N9 RT-PCR反应体系扩增曲线在FAM,VIC检测通道均有对数增长期且FAM检测通道Ct值≤40；可判样品为H7N9禽流感病毒阳性；
　　　　3.如果检测样品的AIV H7或N9 RT-PCR反应体系仅其中之一的扩增曲线满足判为阳性的要求，则需重复检测；若重复检测结果为H7及N9均阳性，则判H7N9禽流感病毒阳性；若重复检测结果仍为H7（或N9）阳性，则只能判禽流感病毒H7（或N9）亚型阳性，并建议以其他方法做进一步确认。
　　　　【检测方法的局限性】
　　　　1.样本检测结果与样本收集、处理、运送及保存质量有关。
　　　　2.样本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果。
　　　　3.病毒在流行过程中的基因突变则也可能导致假阴性结果。
　　　　4.由于不同提取方法的原理不同，采用不同核酸提取试剂进行样本处理时核酸提取效率存在一定差异，本试剂盒推荐使用本公司生产的核酸提取试剂盒（离心柱法），用户可根据具体要求进行选择确认。
　　　　5.本检测结果仅供临床参考，如需确诊病例请结合临床症状及其他检测手段.
　　　　【产品性能指标】
　　　　根据产品分析性能评估结果，本试剂盒的分析灵敏度为1.0×103copies/ml。与感染部位相同或感染症状相似的其他病原体（甲型流感病毒H3亚型、甲型流感病毒H1亚型、乙型流感病毒、副流感病毒、禽流感H5亚型病毒、禽流感H9亚型病毒等）无交叉反应。
　　　　【注意事项】
　　　　1.实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区），所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；
　　　　2.为试剂和标本准备阶段提供生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器；
　　　　3.试剂使用前要完全解冻，8,000rpm离心数秒后使用；
　　　　4.标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃；
　　　　5.实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外线灯处理工作台和移液器；
　　　　6.本试剂盒内阳性质控品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。
　　　　【生产企业】企业名称：中山大学达安基因股份有限公司
　　　　生产地址：广州市高新技术产业开发区香山路19号；广州市高新技术产业开发区荔枝山路6号
　　　　邮   编：510665          
　　　　电   话：020-32290789、8008304008
　　　　传   真：020-32068820   
　　　　网   址：http://www.daangene.com
　　　　【医疗器械生产企业许可证编号】粤食药监械生产许20040999号
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
附件2

人感染H7N9禽流感病毒核酸检测实验室生物安全保障基本要求
 


　　　　为加强人感染H7N9禽流感病毒核酸检测规范化管理，做好实验室生物安全管理工作，根据《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院第424号令，以下简称《管理条例》）、《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（卫生部45号令，以下简称《管理规定》）等有关要求，制定本标准。供医院开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测时参考使用。
　　　　一、样本采集
　　　　（一）进行人感染H7N9禽流感病毒相关样本（以下简称“样本”）采集的操作人员必须经过生物安全培训合格，并具备相应的操作技能。
　　　　（二）样本采集过程中，操作人员要加强防护，应当穿戴防护服、眼罩、N95及以上水平的医用防护口罩、双层医用乳胶手套、帽子等个体防护装备。
　　　　（三）用于样本采集的主容器必须采用优质塑料材质，且大小适合、带螺旋盖、内有垫圈、无菌、耐冷冻的密闭容器。样本采集后，主容器盖必须盖严、拧紧，表面应当擦拭消毒。
　　　　（四）对诊疗过程中采集的各种临床样本，医疗机构应当加强生物安全管理，在进行动态风险沟通与评估基础上，采取样本登记造册、专库存放、专人负责以及必要的消毒处理等较严格的安全及安保管理措施。
　　　　（五）样本采集过程中产生的医疗废物要分类收集，应当在产生地点进行压力蒸汽灭菌或可靠的化学消毒，然后按感染性、损伤性等医疗废物收集处置。
　　　　二、样本包装和运输
　　　　（一）负责样本包装和运输的人员应当经过感染性物质包装、运输相关的生物安全培训，并取得相应资格。
　　　　（二）运输样本必须采取三层包装系统，由内到外分别为主容器、辅助容器和外包装。
　　　　病毒培养物按照A类感染性物质进行包装运输，其他感染性物质按照B类感染性物质进行包装运输。
　　　　容器或包装材料应当达到国际民航组织《危险物品航空安全运输技术细则》相应包装标准，符合防水、防破损、防外泄、耐高温、耐高压的要求。
　　　　（三）样本包装过程中，操作人员要根据所处环境条件参照本标准第一条第二款的相关要求采取加强防护。
　　　　（四）操作人员应当规范包装检测样本：
　　　　1.应当在实验室核心操作区内对装有样本的主容器外表面进行仔细检查并擦拭消毒，确保无泄漏、表面无残留物，并在外表面标明样本编号、种类、姓名及采样日期等信息。用足够的吸收材料包裹主容器，然后放入辅助容器，拧紧（A类）或封严（B类）辅助容器，必要时消毒辅助容器外表面。若多个主容器装入同一个辅助容器时，必须分别包裹，防止彼此接触，并在多个主容器外面衬以足够的吸收材料。
　　　　2.应在实验室清洁区采用适当的衬垫材料将辅助容器固定在贴有统一标识的外包装箱内，冰排或制冷器件应放在辅助容器和外包装之间。样本送检单、样本接收证明、准运证书、运送人员资质证明、发送和接收人员信息等相关文件材料应当放入防水的塑料袋中，置于外包装箱内上方。
　　　　（五）样本运输前应当联系接收机构实验室，告知样本送检目的、样本种类、数量和预计送达的时间等。
　　　　（六）负责运输样本的医疗卫生机构，应当按照《管理规定》有关要求，向省级卫生行政主管部门或中国疾病预防控制中心申请办理《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本准运证书》。在每次运输结束后，运输单位须将运输情况向省级卫生行政主管部门或中国疾病预防控制中心书面报告。
　　　　（七）包装合格的样本（三层包装系统）可通过航空或陆路运输。陆路运输应专车运输，并由2名或以上经培训合格的人员护送。运输途中样本主容器应始终保持直立，运输车辆内应携带具备清单及有效物品的应急处置箱（包），其中包括个体防护装备、感染性材料溢洒处置器具、皮肤及创口处置器具、医疗废物收集器具以及“生物危险”、“禁止通过”等警示标识。有关单位或者个人不得通过公共电（汽）车和城市铁路运输相关样本。
　　　　三、样本接收和包装开启
　　　　（一）负责样本接收与包装开启的操作人员应具备相应的操作技能，通过生物安全培训并取得相应资质。
　　　　（二）样本包装的开启应在生物安全二级及以上级别的实验室进行。样本送检单、准运证书、人员上岗证等相关文件材料的核查、登记，以及相关风险沟通/评估和开具样本接收证明等工作应在实验室清洁区内进行。
　　　　（三）包装开启过程中，操作者要根据所处环境条件参照本标准第一条第二款相关要求适时加强防护。
　　　　（四）实验室操作人员应规范接收检测样本、开启包装：
　　　　1.操作人员应当在生物安全柜内开启三层包装系统的第二层辅助容器，并仔细检查主容器表面有否破损、泄漏或残留物，发现异常情况应当立即执行实验室应急处置程序，同时登记并报告实验室负责人。
　　　　2.操作者应当在生物安全柜内消毒主容器表面，核对样本信息，进行下一步的实验室检测活动，或转移至指定的保存/保藏地点及位置。
　　　　（五）包装开启和样本核查结束后，应当在实验室清洁区完成交接手续，开具样本接收证明，交还外包装和辅助容器等。实验室操作人员应对所有异常情况进行详细记录，运输和接受样本的双方人员签字确认。
　　　　四、样本分装和检测
　　　　（一）负责样本分装、检测的操作人员应当具备人感染H7N9禽流感病毒相应的实验操作能力，经过生物安全培训，并取得培训合格资质。
　　　　（二）实验室用于人感染H7N9禽流感病毒检测的设备、设施必须运行良好，生物安全柜和压力蒸汽灭菌器应当年检合格。
　　　　（三）在生物安全二级实验室从事相关实验活动时，操作人员应当配戴眼罩、N95及以上水平的医学防护口罩，穿戴防护服、双层乳胶手套等个体防护装备。
　　　　（四）实验室生物安全等级要求：
　　　　1.疑似病例未经培养的临床样本应当在生物安全二级实验室的生物安全柜内分装、灭活和核酸提取。
　　　　2.人感染H7N9禽流感病毒的分离培养应当在生物安全三级实验室进行。
　　　　3.动物感染实验应当在动物生物安全三级实验室进行。
　　　　（五）开展人感染H7N9禽流感病毒相关实验活动时，应当有２名以上的操作人员共同进行。
　　　　（六）实验过程中产生的医疗废物要分类收集，应在产生地点进行消毒灭菌，然后按医疗废物收集处置。
　　　　五、样本保存和销毁
　　　　（一）各医疗机构应当将阳性样本按照要求集中专库保存。
　　　　（二）阳性样本、分离物的保存及销毁应当按照《管理条例》等法规和规范性文件有关要求执行。

　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
铁道部


工程设计鉴定若干技术政策的意见（试行）
铁道部



遵照部党组关于设计标准、规范要体现投入产出，适应两个根本性转变的改革精神，针对当前设计鉴定工作存在的主要问题，提出以下意见，作为设计鉴定的暂行依据。
1．铁路的设计年度在现行设计规范分为近、远两期的基础上增加初期年度，初期为正式交付运营后第三年。新建铁路，其初期开站数量、货场规模及站、段配线、生产定员、生活房屋等可按初期运量和运输性质确定；对随着运输发展可以逐步扩建和改建的建筑物和设备，应按近期运
量和运输性质确定，并考虑预留远期发展的可能；对不易扩建或改建的建筑物和设备，应按远期运量和运输性质确定。
对重载线路、客运专线、既有线改造、增建二线和电气化等项目，其设计年度，仍采用近、远两期。
2．各级铁路根据不同的性质与任务，结合地形地质条件，通过多方案比选，确定不同的线路平纵断面、轨道、路基标准及相关设备，正确使用规范。
3．全线各区段运量有较大差别或运输性质有较大差异、运输要求不同时，可结合运输性质、地形地貌等自然条件，通过方案比选，分段采用不同的技术标准和设备标准。
4．Ⅰ级铁路的选线，除必须经过的控制点外，不宜迁就一般城镇而展线。
Ⅱ、Ⅲ级及合资建设的铁路，其线路径路在经济技术比较的基础上综合研究考虑。
5．重视地质选线，对地质复杂地段，通过各种勘探手段，查清地质构造、地层、岩性等工程地质、水文地质条件及对工程的影响，作出正确判断，选好线路方案。
地质严重不良地段，在查明不良地段范围的基础上，尽量绕避；无法绕避时，应进行多方案比选，提出切实可行的工程措施，力求根治，不留后患。
进一步加强桥、隧、路基工点的工程地质和水文地质工作，尽量减少隧道围岩类别，不良地质灾害和桥梁基础的设计变更。
6．新线预留第二线时，平面位置要切实可行，必要时对二线工程作出预设计。在地形、地质复杂地段，为避免修建二线时施工与运输的严重干扰或引起较大废弃工程，应对第二线分修或双线一次建成进行充分论证。
7．既有线改造应根据运量增长的需要，分阶段地逐步加强。对各种加强方案（如技术改造、增开会越所、提高牵引重量、改变牵引动力、修建双线插入段或部分复线、修建双线、双线自动闭塞），通过技术经济比较，合理确定。
8．既有线改建和增建第二线，应尽量利用既有的建筑物和设备，拆改下来的既有设备、材料和物资实行回收，尽量在本项目内利用。
9．曲线半径的选择应由大到小通过比选，合理确定。当工程量增加不大时宁大勿小。
10．路网性干线的新建和既有线改造工程，在确定曲线半径、缓和曲线、道岔号数等要素时要考虑将来提速的可能。
11．区段站的分布应根据路网构成适应车流变化规律，结合长交路、轮乘制的推广，减少区段站设置数量，以加快机车、车辆周转，提高运营效益。
12．办理客货运的中间站的分布，应在满足能力需要的前提下，根据地区经济发展规划，设在能够形成当地经济中心的城镇附近。其设置数量要严格控制。
13．在区段站、中间站合理分布的基础上，根据通过能力和运输需要，合理分布会让站或越行站。
单线铁路的站间距离以不小于8ｋｍ为宜；双线铁路站间距离以15至25ｋｍ为宜。
14．路基工程要避免高填深挖，路堑边坡宜控制在30ｍ之内，路堤边坡宜控制在20ｍ之内，超过此限应进行平剖面优化或与修建桥隧进行比较；确实无法避免时，应切实作好边坡防护和加固工程，不留后患。
深路堑的设计要根据机械化施工的工艺特点，结合地质情况采用分层稳定和坡脚预加固处理。即随挖随护，先桩后墙，留够平台，做好排水。
15．重视路基填料选用和路基基底加固，加强路基填土压实，特别是边坡压实。平原地区路基，一般不应在两侧取土，避免形成“一条线两道河”危及路基安全。加强路堑边坡防护和支挡工程，提倡采用技术成熟的新型支挡构筑物。
16．特重型轨道应采用一级道碴。其他Ⅰ级干线一般也宜采用Ⅰ级道碴。改建既有线和增建二线，原则上扩建既有碴场；新线建设，也应优先考虑扩建符合标准的既有碴场。
必须新建碴场时，要根据材质、储量、开采条件、接轨条件进行方案比选，并可采用与地方集资方式修建多功能采石场。今后原则上不再扩建不符合Ⅰ级道碴标准的永久性碴场。
17．特大桥梁一般不再建桥头堡。中等跨度的桥梁在经过技术经济比较的基础上优先采用予应力混凝土结构。32ｍ及以下梁跨原则上不再采用钢结构。
18．新线建设应满足国家防洪标准。既有线改造、增建二线、既有线电气化改造等工程，原则上也应符合国家防洪标准；当工程过大或改造困难时，可根据多年运营实际和水害的具体情况，逐步达标。
19．严格控制平交道口数量，当道口交通量达到国家规定且有立交条件时，可修建立交；国道、省道公路及城市干道与路网性双线铁路交叉时原则上立交。投资划分应按国家有关规定执行。
20．线路与河渠、道路斜交，设计为板（箱）涵或框架桥时，一般应“斜桥（涵）斜做”，并尽量做斜出入口。
21．农田水网区，小桥涵不应逢渠设涵，应根据具体情况适当合并和调正通航条件，以减少工程量。
22．长大和重点隧道，平面位置的选择要着眼于区域地质，要在综合地质勘探和大面积地质调绘基础上确定线路走向，并应根据合理工期，对施工方案、施工方法，进行多方案比选。
对小隧道群要慎重对待，要与长隧道方案作比选，一般情况下应优先选用长隧道。要继续贯彻早进晚出的原则，合理选定洞门位置。
23．应根据合理工期及出碴、通风等要求慎重设置辅助坑道，并充分发挥其地质勘探、排水和运营期间特殊需求等综合作用。
24．隧道施工设计应根据施工开挖后揭示出的地质变化，及时修正施工方案，结合施工实际调整施工方法和支护型式、参数。
25．隧道弃方应合理调配尽量利用。多余弃碴的防护处理应满足环保要求，有条件时，尽量作到造地还田。
26．认真研究编组站在路网上的分布和相邻编组站的合理分工。长大干线，应按片区范围认真研究技术站的合理分布，创造条件组织直达运输，减少技术站的数量。
27．从长远发展着眼作好枢纽总图。新线引入枢纽要符合总图要求，编组站及疏解线的建设要根据运量发展在总图规划的指导下分期实施，严格控制近期规模，以减少和推迟土地占用，节约近期投资。
对枢纽及疏解、联络线的远期用地，应按总图要求合理预留，纳入城乡发展规划。
28．枢纽改建要以扩能为主，其设施的改善宜从严控制，随运量增长逐步解决。对老设备的利用应优先考虑，对原有的合理的运输组织措施，应尽量保留利用，以免加大工程规模，尽量避免大拆大改。
29．路网性编组站逐步实现综合自动化；其他作业量较大的区域性、地区性编组站逐步实现驼峰自动化或半自动化；作业量较小的地区性编组站、区段站可采用简易的技术装备，逐步取消铁鞋制动、人工扳道和手信号。
大中型驼峰宜采用点连式调速制式；小型驼峰积极推广简易调速制式。
30．改建铁路应尽量少改动既有车站的平、纵断面，在条件受限的情况下，为避免引起较大改建工程，既有小曲线半径、小号码道岔及不危及限界要求的小股道间距，经部批准，可暂予保留利用，逐步改善。
31．枢纽主要技术站衔接方向多，股道有效长应结合各引入方向情况，合理采用长短线结合的方案。
改建铁路，延长到发线有效长时，应根据运输需要和工程实际，经过分析，延长部分车站或车站的部分股道的有效长，以节约投资。
32．枢纽地区进出站引入线、疏解线及联络线的方案注意车流径路的合理性，线路标准、钢轨类型、轨枕数量可按该线路的年通过总量确定，以节省工程投资。
33．货场建设要作好总体规划，纳入城建发展规划。
原则上一个县建一处货场，但年运量小于10万ｔ的车站一般不建货场。
货场修建可采用多种渠道集资分期建设。
新线建设按初期运量，在货场总体规划的基础上，先修建少量设施，不配装卸机械。随着运输的发展，通过集资逐步扩大。
34．要加快改变铁路通信落后面貌的步伐。通信设计除应满足电话、电报业务外，亦应根据铁路运营管理等信息系统、各项遥控、遥测系统的信息量、技术指标及可靠性等要求，统筹安排，以满足各种信息传递的需要。
35．通信网应实行由模拟通信向数字通信过渡，根据运输繁忙程度和在铁路通信网中的地位，采用不同的标准。电话普及率按部统一标准执行。
干线铁路通信传输系统一般为光缆，容量可适当留有余地，新建交换机一般应采用数字程控交换机。
36．发展电气集中，积极采用微机联锁。
37．新建铁路及增建二线工程，按初、近期运量要求，分期采用不同标准的区间闭塞制式。
38．改扩建工程中，安排好施工程序，信号设备力求一次施工。两个（或数个）工程项目，同在一站接轨，且工期较近，宜考虑一次设计、施工。
一项工程由几个单位联合设计者，必须按工程范围，由总体设计单位统一提报完整的、相互协调的设计文件和工程概算。
39．基建工程中，利用外资采购技术设备并用内资配套的工程项目，应按正常程序报批设计及概算并落实内资配套费；其技术规格书和采购设备的种类、规格、标准、数量应符合鉴定意见；在采购过程中，凡变更鉴定意见，必须按变更设计办法报部审批。
40．新建与改建铁路，对一个铁路局管内的机车中修、车辆段修的检修能力，应统一考虑，集中修理。机车的小修、辅修由机车配属段承担，机车运用段只支配机车，不承担检修任务。
41．在推行长交路和车辆质量逐步提高的前提下，应逐步加大列检间隔和推行两检制（作始发、到达列检，不作通过列检），不再设一般列检所。
42．改革维修体制，逐步推行同一地区的工、电、水、装卸机械等系统（或部分系统）的维修、加工、电镀、仪表修理等合并成立综合维修中心，提高工效和设备利用率，减少设备、定员、房屋和投资。
43．既有站改造，如铁路有独立水源应尽量利用；如既有水源能力不足需扩容，可在考虑解决新增水源时，统筹解决既有供水不足问题，投资需按新增及既有增容水量合理分摊。
44．Ⅰ、Ⅱ级干线的电气化铁道正线接触网原则上不再设计为简单悬挂方式并采用高强度、耐腐蚀、少维修的接触网零部件以提高电气化铁路的运行可靠性。
45．双线电气化区段，供电设计是否需要具备反向行车条件，应结合能力和运量的具体情况分析确定，当需要具备反向行车条件时，其Ｖ型综合维修天窗的停电单元划分，应根据行车组织的需要、线路设备和供电设备情况，通过综合比选确定。
46．各站段工区的交通工具不再分别配置，改按投资的一定比例划给路局，由路局统筹考虑。
47．文、教、卫系统应积极稳妥的向社会化过渡。并尽量向县城以上地区集中；
有条件时尽量利用地方中学，少设或不设铁路中学；
住宅区集中的地区可暂按现行规范设小学和幼儿园，但要从严控制，可适当提高办学条件和标准；
既有线改造及增建二线工程中一般不再新建扩建铁路医院，可适当加强沿线卫生所。
48．根据劳动用工制度改革精神，对客车乘务员、货场装卸工等服务性较强的定员宜单独计列，暂可使用临时性合同工，不配生活房屋，只计列休息和部分单身宿舍。
49．房屋建设要认真作好站区总图的建筑规划设计。做到正确选址、合理分区、布局紧凑、近远期结合、节约用地。
在丘陵及山坡地的房屋及构筑物的设置，在生产性质、工艺流程和运输要求允许条件下，宜分台阶错落布置，充分利用地形，以减少土石方及基础工程量。
50．站区内道路、堆场、排水、护坡、挡墙、围墙、绿地等室外配套工程，宜尽量结合环境条件优化设计、减少建筑附属工程量。
51．严格控制各站、段办公用房面积；严格按有关规定和标准设置空调。同一地区的车务、工务、电务、水电、建筑等段、所的生产办公房屋，应就近组合，修建多层办公楼，以节约用地和辅助设施。生产、生活房屋较为集中的工区、领工区、站、段宜集中采暖，集中供水、供热，
以利环保、节能和降低工程造价。
52．随着通信、信号设备数字化、微机化，其房屋的设计不应再套用原定型图，面积要压缩，非生产房屋要控制，发展要预留。其它专业也应根据设备更新，对生产房屋的组成作相应的调整。
53．较大站区，可合资修建综合性站屋，建成后交由铁路统一管理，面积要严格控制，对地方政府要求增加的面积和提高建筑标准的部分应由地方投资。
54．本着有利生产方便生活的原则，尽量将沿线小站的职工住宅，集中于县城以上铁路地区修建。
55．新建、改建铁路的生活房屋可按技术设计批准的总面积和相应的总投资拨给所属铁路局，由铁路局结合房改统筹建设，不再调整概算。
56．认真作好房屋和“三电”等拆迁调查和丈量工作。拆迁应根据设计单位的实地测绘、调查资料，或经证实的可靠资料，不得目估和委请其它单位提供数量。既有铁路房屋拆迁，需抄建筑段台账，并经现场详细核对。
57．节约土地为我国国策，各专业都要严格执行。既有用地需取得用地图并经现场核对；设计的用地应由主体专业汇总（几个设计单位承担一项工程，需由总体单位汇总），并表示在排水用地图上，以避免宽打窄用和重复征地。有条件时，可利用取土坑、弃土堆造地还田。
设计铁路用地，按近期需要一次征购。对远期规划用地，应表示清楚，报城建规划部门，予以保留控制。
58．铁路绿化，要在铁路用地界内逐步规划进行，绿化育苗要因地制宜，可利用取土坑和原有苗圃，运营后逐年完成。
59．必须加强施工组织设计，提出经济可行的指导性施工组织设计方案意见。根据工期要求，注意均衡生产，合理设置大临，充分考虑永临结合，减少临时工程及过渡工程费用。
60．加强现场概算基础资料的调查收集工作，力求材料供应计划切实可行，使概算编制准确，反映实际。对重点工程的施工组织，包括施工方案、步骤、劳力组织及工期、地质水文及施工条件，要详细调查，并作好方案经济比选。
61．各设计阶段均应按部颁编制办法的深度要求，编制项目总概算，并附项目总概算及综合概算汇总表。技术设计修正总概算，应与初步设计总概算进行详细对比分析。对于超出概算额的部分，应有详细说明。
62．变更设计要严格按铁路基建变更设计办法执行。Ⅰ类变更设计，由原设计单位报送变更设计文件并附工程数量及费用增减对照表，经部批准后，纳入总概算。Ⅱ、Ⅲ类变更设计，应严格控制，在备用费中解决，“九五”新项目不再考虑增加备用费。
施工图设计较技术设计增加的工程规模及工程量原则上不予承认；当地料差、电、水价差，运价差等应统一取费原则，在有关部门配合支持下加快和简化调概工作。
63．要积极采用、推广经实践证明或部鉴定的新技术、新设备，对没有经过实践的新技术、新设备经试验和论证认为可行者可在次要线路上试用，成功后再推广。为本工程需要的试验项目的立项要从严掌握。



1996年12月19日